Urodził się w Wierzchosławicach k. Tarnowa, w biednej chłopskiej rodzinie posiadającej dwumorgowe gospodarstwo. Przez cztery lata uczył się w szkole wiejskiej, po czym pomagał w utrzymaniu rodziny jako drwal. Wiedzę nieustannie uzupełniał przez samokształcenie. Publikował artykuły w tygodniku „Przyjaciel Ludu”, będącym organem prasowym Stronnictwa Ludowego.

W 1895 r. związał się z ruchem ludowym w Galicji i szybko stał się jednym z jego liderów. W lutym 1908 r. został posłem do galicyjskiego Sejmu Krajowego we Lwowie, a trzy lata później – do austriackiego parlamentu w Wiedniu.

W czasie I wojny światowej Witos przechodził stopniowo od orientacji proaustriackiej (popierał tworzenie Legionów Polskich) do krytyki wobec polityki Austro-Węgier. Wspierał Józefa Piłsudskiego, zwłaszcza po jego internowaniu w Magdeburgu. W maju 1917 r. był współinicjatorem rezolucji Koła Polskiego w Wiedniu, które uchwaliło: „Jedynym dążeniem narodu polskiego jest odzyskanie niepodległej, zjednoczonej Polski z dostępem do morza”.

28 października 1918 r., wobec bankructwa monarchii austro-węgierskiej, Wincenty Witos stanął na czele powołanej w Krakowie Polskiej Komisji Likwidacyjnej – tymczasowego organu polskiej władzy dla zaboru austriackiego oraz Śląska Cieszyńskiego. Jej zadaniem było przede wszystkim utrzymanie bezpieczeństwa i spokoju publicznego do czasu utworzenia niepodległego państwa polskiego, a także tworzenie zrębów polskiej administracji i polskiego wojska.

Mimo propozycji Witos odmówił wejścia do Tymczasowego Rządu Ludowego Republiki Polskiej, utworzonego w Lublinie przez Ignacego Daszyńskiego, ponieważ nie odzwierciedlał on układu sił politycznych w odbudowywanej Polsce. Z tych samych względów nie wszedł również do rządu Jędrzeja Moraczewskiego.

W obliczu zagrożenia bolszewickiego 24 lipca 1920 r., na prośbę Piłsudskiego, jako premier stanął na czele Rządu Obrony Narodowej, który był złożony ze wszystkich sił parlamentarnych. Miał doprowadzić do konsolidacji społeczeństwa i wsparcia wysiłku wojennego przez masy chłopskie, co mu się w pełni udało.

Jako wytrawny polityk i lider Polskiego Stronnictwa Ludowego „Piast” – największej partii chłopskiej w Sejmie – Witos jeszcze dwukrotnie pełnił funkcję szefa rządu. W 1926 r., po kilku dniach urzędowania na tym stanowisku, został zmuszony do ustąpienia na skutek przewrotu majowego.

Jako zdecydowany przeciwnik obozu politycznego marszałka Piłsudskiego stał się jednym z najważniejszych przywódców opozycyjnych. Doprowadził do porozumienia środowisk lewicowych i centrowych, a także był współorganizatorem i aktywnym uczestnikiem Kongresu Obrony Prawa i Wolności Ludu w Krakowie w 1930 r.

W 1931 r. w czasie tzw. procesu brzeskiego zarzucono mu przygotowywanie zamachu stanu. Żeby uniknąć aresztowania, udał się na emigrację, skąd wrócił do Polski na krótko przed wybuchem wojny w 1939 r. Ponownie wybrany na stanowisko prezesa Stronnictwa Ludowego wydał odezwę zawierającą wezwanie do obrony niepodległości kraju.

W czasie II wojny światowej wielokrotnie, mimo aresztowania, odmówił Niemcom utworzenia kolaboracyjnego polskiego rządu. Odmawiał też współpracy po wojnie z władzami narzuconymi przez Związek Radziecki.

Zmarł 31 października 1945 r. Został pochowany na cmentarzu w rodzinnych Wierzchosławicach.